رنگ آمیزی گرم
این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمی
زی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتیبه ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می شود
گرچه هر دو گروه یعنی باکتریهای گرم مثبت و منفی دارای دیواره می‌باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت یک لایه ضخیمی‌است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتریهای گرم منفی ضخامت آن به حداقل می‌رسد.
بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.
از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.
اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.
در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به ۵ گروه تقسیم بندی می کنند:
۱- میله ای (باسیل ) گرم مثبت ۲- میله ای گرم منفی ۳- کوکوس (گرد) گرم مثبت ۴- کوکوس گرم منفی ۵- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.
در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این ۵ گروه قرار داده و با اطمینان ۴ گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .
خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :
۱- باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
۲- گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
۳- باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
۴- باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.
کاربرد رنگ آمیزی گرم
از رنگ‌آمیزی گرم به دو جهت استفاده می‌شود:
- شناسایی جنس باکتری
- انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب (باکتریهای گرم مثبت در مقایسه با باکتریهای گرم منفی نسبت به پنی‌سیلین G حسّاسیت بیشتری دارند(
با این حال همهٔ باکتریها را نمی‌توان با رنگ‌آمیزی گرم مشاهده نمود
روش انجام آزمایش:
۱- رنگ کریستال ویوله رابه مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد
۲- پس از شستشو گسترش با آب به مدت ۳۰تا۴۵ ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .
مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .
۴- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .
نظرات شما عزیزان:
